مطالعه قسمت اول مقاله ژل رویال و بیماران مبتلا به درماتیت
ادامه روش های اجرای آزمایش
در ادامه کار و پس از مراحل ابتدایی، ادامه روش ها را مطالعه می کنیم
Western blotting ( یک روش آزمایشگاهی برای ردیابی مولکول های خاص پروتئین از میان مخلوطی از آنها )
الکتروفورز ژل پلی اکریل امید – سولفات دو دسیل سدیم (SDS-PAGE) با استفاده از یک پیش قالب بین 10 تا 20 % ژل قوس صعودی و نزولی و صفحه ژل واقعی SDG-592 انجام شد (BIO CRAFT, Tokyo, Japan). ژل رویال خشکانده شده با انجماد به غلظت 2 میلی گرم/ میلی لیتر در یک بافر نمونه فراهم شد ( 62.5 mM Tris ، 2 w/w% SDS، 10 w/v% گلیسرول، و 0.1M دی تیوتریتول ) و به مدت 5 دقیقه در 110 درجه سانتی گراد گرم شد، و سپس 143 میکرولیتر از محلول بداخل یک چاه عظیم بارگذاری شد ( 286 میکرو گرم از ژل رویال/ 143 میکرولیتر ). رنگ مضاعق استانداردهای از پیش رنگ شده ی پروتئین به علاوه دقت (Bio-Rad, Hercules, CA) به عنوان یک مارکر وزن مولکولی مورد استفاده قرار گرفت. پروتئین های جدا شده از ژل بوسیله رنگ آمیزی آبی کوماسی با آب EzStain ردیابی شدند (ATTO, Tokyo, Japan). پس از SDS-PAGE ، پروتئین های جدا شده از ژل به غشاهای دی فلورید پلی وینیلیدین انتقال الکترونی داده شدند (Clear Blot Membrane-P plus, ATTO) که به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شده، به نوارهایی برش داده شدند (75 در 8 میلی متر ) و طی شبانه روز در 1 میلی لیتر از سرم بیمار درماتیت مرتبط با آلرژی در دمای 4 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. بعد از شستن با TBS-T ، این غشاها به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با یک آنتی بادی ضد انسانی موش توام با HRP (Abcam) انکوبه شده، ده هزار برابر در یک محلول TBS-T رقیق شدند. آنتی بادی دوم با معرف ردیابی ECL Prime Western Blotting ردیابی شد ( علوم مراقبت بهداشتی GE ، مارل بورو، MA ) ، و روشنایی شیمیایی با Ez-Capture MG (ATTO) مشاهده شد.
SPT
یک SPT با استفاده از محلول های ژل رویال خام رقیق نشده ، 10/1 ، و 100/1 برای سوژه های شماره 38 ، 44 و 48 اجرا شد، که یک پاسخ مثبت نسبت به ژل رویال بوسیله ELISA نشان می دادند. دی ئیدروکلرید هیستامین با غلظت 10 میلی گرم / میلی لیتر و یک محلول نمکی به ترتیب به عنوان کنترل های مثبت و منفی مورد استفاده قرار گرفتند. واکنش های پوستی در 15 دقیقه پس از کاربرد تخمین زده شدند. طولانی ترین قطر خارش پوستی (D)و قطر عمود بر D (d)اندازه گیری شدند. نتایج به صورت میانگین محاسبه شده به صورت (D + d)/2 با یک نتیجه 3 میلی متر یا بزرگ تر مثبت درنظر گرفته می شوند.
آنالیز آماری
تست همبستگی رتبه Spearman مورد استفاده قرار گرفت تا رابطه های بین تیتر آنتی بادی ضد ژل رویال و نتایج ارزیابی زیر برای درماتیت مرتبط با آلرژی را ارزیابی کند : تیتر IgE غیر خاص، نمره EASI ، نمره رده بندی برمبنای IgE ViewAllergyTM39 سطح TARC ، و سطح LD . تست Welch’s t- به منظور مقایسه کردن آزمایش های بازدارندگی ELISA با و بدون پیش انکوباسیون با مواد آلرژی زای تست اجرا شد. مقادیر P < 0.05, 0.01, و 0.001 از نظر آماری معنا دار درنظرگرفته شدند. همه آنالیزها با استفاده از 1.16 نسخه Ekuseru-Toukei 2012 برای ویندوز اجرا شدند ( شرکت اطلاعات تحقیق بررسی اجتماعی، توکیو، ژاپن).
نتایج
ردیابی آنتی بادی های IgE خاص ژل رویال در بیماران درماتیت مرتبط با آلرژی
نمونه های سرم از بیماران درماتیت مرتبط با آلرژی توسط ELISA ارزیابی شده تا آنتی بادی های IgE خاص ژل رویال در آزمایش ELISA ردیابی شود، ده بیمار از 30 بیمار درماتیت مرتبط با آلرژی یک نتیجه مثبت نشان دادند، و تیترهای آنتی بادی های شان در محدوده بین 2-4 ، 048 برابر بود. آنالیز Western Blotting با استفاده از نمونه های سرم بدست آمده از بیماران درماتیت مرتبط با آلرژی با با تیترهای آنتی بادی نسبتاً بالا هدایت شد، بویژه آنهایی که از سوژه شماره 36 ، 39 و 44 بودند. آنتی بادی های IgE در نمونه های سرم بدست آمده از بیماران درماتیت مرتبط با آلرژی پروتئین های مشابهی تشخیص دادند که در نمونه های سرم بدست آمده از سوژه های حساسیت دار به ژل رویال با شماره های 8 ، 11 و 14 ردیاب شده بودند. نتایج برای آنتی بادی های IgE غیر ویژه و نمره های EASI در جدول 1 آمده اند. نمره های تست های همزمان چند ماده آلرژی زا، View AllergyTM39, در جدول آمده اند، و نتایج برای مقادیر TARC ، ائوزینوفیل ها، و مقادیر بیماران درماتیت مرتبط با آلرژی در جدول آمده اند.
همبستگی های بین تیترهای آنتی بادی ضد ژل رویال و پارامترهای سرمی
شکل 2 رابطه های بین تیتر آنتی بادی ضد ژل رویال و یافته های بررسی بالینی را نشان می دهد. تیتر آنتی بادی ضد ژل رویال به طرز معناداری با مقادیر IgE غیر ویژه و نمره های EASI همبستگی داشت. مقادیر Spearman’s rho برای مقادیر IgE غیر ویژه یا نمره های EASI در مقابل تیتر آنتی بادی به ترتیب 631/0 و 692/0 بودند. مقادیر TARC ، ائوزینوفیل ها، و مقادیر LD هیچ همبستگی معناداری با تیترهای آنتی بادی ضد ژل رویال نداشت. به علاوه، جدول 2 همبستگی های بین تیتر آنتی بادی ضد ژل رویال و نمره تست ViewAllergyTM39 را نشان می دهد. ضرایب همبستگی بالا برای HDM (0.589) ، Malassezia (0.677) ، دانه های کنجد (0.669) ، میگو (0.594) ، خرچنگ (0.670) ، گندم گاوی (0.597) ، موز (0.670) ، و کچوله (0.625) مشاهده شدند.
شناسایی مواد آلرژی زای دارای واکنش متقابل با ژل رویال
به منظور بررسی کردن مواد آلرژی زای دارای واکنش متقابل با پروتئین ژل رویال، 14 ماده آلرژی زا بر اساس نتایج تست همبستگی و اهمیت آلرژی زایی شان انتخاب شدند. شکل 3 نتیجه یک آزمایش بازدارندگی ELISA با 5 نمونه سرم بیمار نماینده را نشان می دهد که با ملاحظه ی تیتر های آنتی بادی ضد ژل رویال بالا رفته شان مطابق با جدول 1 انتخاب شدند. بازدارندگی قابل ملاحظه پاسخ به ژل رویال، نشان داده شده به صورت کاهشی در جذب سطحی با این موارد مشاهده شد : HDM (3/5) اروپایی ، HDM (3/5) امریکایی، خرچنگ برف (3/5) ، زهر زنبورعسل (4/5) ، خرچنگ خوراکی (1/5) ، و سوسک حمام آلمانی (1/5) . بهرحال، فلس های گربه، گرده سدر ژاپنی، گرده آرتمیزیای ژاپنی، گرده علف تیموتی، میگوی صورتی آلاسکایی، بید کرم ابریشم، بادام زمینی، و کاه گندم گاوی به طور معناداری از پاسخ به ژل رویال بازدارندگی نکردند.
SPT
ما SPT ها را با غلظت های متفاوت یک محلول ژل رویال در 3 بیمار درماتیت مرتبط با آلرژی ( شماره 44 ، 38 ، و 48 ) اجرا کردیم. پاسخ های مثبت در همه سوژه های تست شده مشاهده شدند : سوژه شماره 44 و 48 مثبت بودند با محلول های رقیق نشده، 1/10 و 1/100 ژل رویال ، و 38 فقط با محلول رقیق نشده ژل رویال مثبت بود.
قسمت انتهایی مقاله را در مطلب بعدی مشاهده کنید
